Czy badanie WES może się różnić między laboratoriami?

Celem zawsze powinna być diagnoza
Zanim omówimy kwestie techniczne dotyczące WES, warto podkreślić, że celem tego badania jest dążenie do postawienia diagnozy pacjenta. Dlaczego o tym wspominamy? Ogromna ilość danych genetycznych, jaka płynie z badania całego eksomu (kilkadziesiąt tysięcy wariantów genetycznych wykrywanych u każdego badanego) stwarza nie lada wyzwanie, by odnaleźć zmiany, które z największym prawdopodobieństwem będą korelować z obrazem klinicznym pacjenta. Trzeba umiejętnie filtrować te dane, które są lub mogą być istotne dla pacjenta, pomijając raportowanie tych wariantów, które nie mają znaczenia dla jego objawów. Wszystko po to, by nie wywoływać niepotrzebnych nerwów i nie spowalniać procesu diagnostycznego.

Jasne i aktualne wytyczne
W tym celu w IMAGENE.ME wykorzystujemy narzędzia w postaci międzynarodowych standardów ACMG/AMP (American College of Medical Genetics and Genomics / Association for Molecular Pathology, NIH – National Institutes of Health, USA) i zalecenia ClinGen (The Clinical Genome, NIH – National Institutes of Health, USA) oraz ACGS (The Association for Clinical Genomic Science, UK).

To ogromny zasób wytycznych, dzięki którym jesteśmy w stanie ocenić istotność każdej zmiany genetycznej. W IMAGENE.ME podczas analizy i interpretacji wyników WES cały zespół pracuje z wykorzystaniem dokumentów proceduralnych przygotowanych przez dr Karolinę Chwiałkowską, członka grupy eksperckiej ClinGen, która jest kuratorem i recenzentem interpretacji patogenności wariantów genetycznych w tej organizacji oraz liderem zespołu biotechnologicznego IMAGENE.ME.

Kompletny zespół diagnostyczny i współpraca z lekarzami genetykami klinicznymi
Poza oceną molekularną wariantów, kluczowa dla pacjenta jest również ocena kliniczna przez doświadczonych lekarzy genetyków, którzy na podstawie historii pacjenta, szczegółowych opisów objawów, wyników badań i zdjęć przesyłanych przez rodziców, mogą ocenić czy dany wariant będzie miał charakter przyczynowy. Dzięki współpracy specjalistów z różnych dziedzin, jak biotechnolodzy, bioinformatycy, diagności laboratoryjni i lekarze, możemy zapewnić indywidualne podejście do każdej badanej rodziny. Każdy wynik w IMAGENE.ME analizowany i interpretowany jest w tak szerokim multidyscyplinarnym zespole, co odpowiada światowym standardom, ale nie jest powszechne w jednostkach oferujących badania WES na rynku polskim. Takie podejście umożliwia nam precyzyjne typowanie zmian genetycznych, które są istotne kliniczne w odniesieniu do celu badania i będą miały wartość diagnostyczną dla lekarza prowadzącego.

Certyfikacja przez największe światowe instytucje genetyczne
Istotną kwestią dotyczącą każdego laboratorium jest podnoszenie swoich kwalifikacji i sprawdzanie jakości. W IMAGENE.ME poddajemy corocznie nasze postępowanie diagnostyczne w ramach badania WES zewnętrznym audytom organizacji takich, jak EMQN i GenQA – to jedne z najważniejszych światowych organizacji oceniających postępowania diagnostyczne prowadzone z wykorzystaniem metody WES. Nasze procedury oraz wydawane raporty zawsze były oceniane jako bezbłędne i z najwyższą możliwą punktacją.

Raportowanie tylko istotnych zmian
Są to niezwykle kluczowe aspekty, które pozwalają nam na jak najbardziej precyzyjną analizę i typowanie zmian o potencjalnie realnym znaczeniu dla pacjenta. Chcemy uczulić wszystkich na to, że raportowanie w badaniu WES jak największej liczby zmian nie jest dobrym podejściem w diagnostyce. Bardzo często w swojej praktyce spotykaliśmy się z tego typu przypadkami i pytaniami, dlaczego w wyniku z innych jednostek zostało zaraportowane więcej wariantów. Jak się często okazuje, większość tych zmian nie jest analizowana szczegółowo z uwzględnieniem klasyfikacji ACMG oraz penetracji cechy dla danego genu. Często są to zmiany bez związku z fenotypem pacjenta lub rzadkie zmiany niepowiązane dotychczas z jednostkami chorobowymi – każdy z nas może posiadać takie warianty w swoim DNA i wcale nie muszą one prowadzić do choroby. Wskazywanie wielu wariantów bez szczegółowej oceny zgodności z klinicznymi cechami chorego może prowadzić do nadinterpretacji wyniku przez osobę badaną lub jej rodziców, a nawet do podejmowania niewłaściwych działań medycznych względem chorego, co mogłoby mieć negatywny wpływ na jego zdrowie!

Precyzyjny sposób przedstawiania informacji
Tutaj mamy też odpowiedź na pytanie, dlaczego lekarze genetycy nie biorą pod uwagę niektórych zaraportowanych zmian – ponieważ nie mają one istotnego znaczenia klinicznego dla pacjenta, jak np. raportowane heterozygotycznego nosicielstwa chorób dziedziczonych recesywnie, a więc takiego w którym obecność zmian na drugim chromosomie jest konieczna, by choroba wystąpiła, czy wariantów niezwiązanych zupełnie z objawami pacjenta. By ułatwić lekarzom, pacjentom oraz rodzicom małych pacjentów zrozumienie wyniku badania, obraliśmy podejście informowania w sprawozdaniu o jak największej liczbie informacji dotyczących zidentyfikowanego wariantu. Każdorazowo przedstawiamy opis genu, którego dotyczy zmiana, molekularny skutek tej zmiany, informacje z literatury czy znaczenie kliniczne.

Maksymalne wykorzystanie technologii badania WES
Odnosząc się do technicznych różnić w badaniach WES, pierwszą kwestią jest zakres badanych regionów. Tutaj należałoby wyjaśnić na czym w ogóle badanie WES polega od strony laboratoryjnej: po izolacji, DNA pacjenta jest fragmentowane, a następnie specjalnym zestawem sond wyłapuje się tylko fragmenty DNA, które są objęte danym badaniem – w przypadku WES jest to zatem ok. 1-1.5% genomu. Można korzystać z dostępnych na rynku zestawów sond do WES, ale obejmują one tylko regiony eksonów – głównie regionów kodujących białka. Wykorzystywana technologia daje natomiast wiele więcej możliwości, z których korzystamy w IMAGENE.ME.

Nasi specjaliści to doświadczeni eksperci w zakresie wykonywania badań bazujących na sekwencjonowaniu następnej generacji (NGS). W IMAGENE.ME wykorzystujemy autorską technologię WES^EXT pozwalającą na sekwencjonowanie regionów poza podstawowym eksomem, które również zawierają znane zmiany patogenne lub są istotne w wykonywaniu dodatkowych analiz: promotory, introny, rejony międzygenowe i mitochondrialne DNA. Łącznie analizujemy aż 47 milionów par zasad (=punktów w DNA). Niektóre badania WES obejmują analizą np. tylko 37 milionów par zasad i nie zawierają dodanych przez nas obszarów, zatem badane jest aż o 10 milionów par zasad mniej. Dodatkowo, wykonujemy analizę zmian liczby kopii (CNV), odpowiadającą w części zakresu badaniu mikromacierzy aCGH, a dzięki wykorzystaniu nowych algorytmów bioinformatycznych możemy przeprowadzać analizę disomii jednorodzicielskich w badaniach TRIO, analizę delecji w obrębie genów SMN1 i SMN2 w kierunku diagnostyki SMA (rdzeniowy zanik mięśni) w przypadku wskazań do tego badania, a także badać predyspozycje farmakogenomiczne. Dzięki temu, możliwości diagnostyczne oferowanego przez nas badania są bardzo szerokie. Większość laboratoriów ogranicza zakres swoich analiz do podstawowych możliwości WES, czyli analizy zmian punktowych w eksonach w obrębie genomu jądrowego. Warto więc zapoznać się z zakresem oferowanej analizy przed wyborem badania. W IMAGENE.ME technologia WES^EXT jest standardem, u każdej osoby analizujemy najszerszy możliwy zakres badania WES – nie oferujemy pakietów podstawowych lub rozszerzonych.

Raportowanie zmian drugorzędnych
Zgodnie z wytycznymi ACMG laboratorium wykonujące badanie genetyczne w technikach wielkoskalowych, takich jak WES czy WGS powinno informować osobę badaną (po wyrażeniu zgody) o obecności tzw. danych drugorzędnych, czyli istotnych klinicznie wariantów genetycznych, które mogą predysponować do rozwoju chorób w ciągu całego życia np. choroby nowotworowej czy zaburzeń pracy serca (więcej informacji w tym artykule – https://www.facebook.com/imagene.future/photos/gm.771206963880720/1450652578784377/ ). W IMAGENE.ME dzięki zastosowaniu procedur klasyfikacji wariantów wg ACMG i ClinGen oferujemy dokładną interpretację wykrywanych zmian i raportujemy tylko te, które istotnie mogą wiązać się z ryzykiem wystąpienia danej choroby.

Weryfikacja jakości danych z innej jednostki
Niestety wymienione różnice wynikające z technologii mogą stwarzać ograniczenia podczas reanalizy danych z innych jednostek. Różnice w zakresie regionów genomu objętych badaniem , wynikające z zastosowania innego panelu sond do WES, nie pozwalają na wykonanie m.in. standardowej analizy CNV czy analizy predyspozycji farmakogenomicznych. Dostarczane dane mogą być też innej, czasem gorszej jakości. Wówczas tzw. głębokość pokrycia (ile razy dana pozycja była zsekwencjonowana) może być znacznie niższa. Tu pojawia się istotna kwestia tego, czy laboratorium udostępnia tzw. surowe dane, które można wykorzystać do reanalizy.

Jasne kryteria wykonywania reanalizy
Może to być szczególnie istotne dla pacjentów, u których badanie WES nie pozwoliło na wskazanie diagnozy. W takich przypadkach zaleca się reanalizę po dwóch latach, ze względu na możliwość pojawienia się nowych powiązań genów z chorobami, informacji o wariantach czy ich reklasyfikacji. Przykładowo, dla zmiany uważanej za patogenną mogły pojawić się badania funkcjonalne, które wskazały brak istotnego efektu zaburzającego funkcjonowanie białek czy procesów komórkowych. Reanaliza może być też szczególnie istotna, jeśli po pewnym czasie pojawiły się u pacjenta nowe objawy, które mogą okazać się istotne dla diagnostyki.

Stworzenie dla pacjentów planu efektywnego korzystania z danych o swoim zdrowiu
Idea posiadania swoich danych genomicznych od zawsze dla nas wiązała się z oferowaniem możliwości reanalizy, ale również ich wykorzystania w dowolnym momencie życia do innych celów, jak wykonanie analizy pod kątem predyspozycji do nowotworów czy chorób kardiologicznych. Pod względem technologicznym system IMAGENE.ME od początku został zaprojektowany tak, aby pacjent wchodzący do systemu mógł mieć bezpiecznie i długofalowo gromadzone informacje genomiczne, informacje o swoim stanie zdrowia czy raport diagnostyczny – tak, aby przy reanalizie danych łatwo dodawać nowe objawy pacjenta i porównywać różnice pomiędzy raportami.

Aplikacja IMAGENE.ME – wyróżnik w światowej skali
Co więcej, nasi dorośli użytkownicy mają możliwość korzystania z aplikacji prozdrowotnej IMAGENE.ME, w której dane genomiczne są interpretowane w kierunku informacyjnym, podnoszą świadomość o własnych predyspozycjach i wpływają na zmianę postawy na prozdrowotną. Za kilka miesięcy aplikacja zostanie rozszerzona o moduł konsultacji danych z lekarzami, co jest unikalnym rozwiązanie w skali światowej i certyfikowane jako wyrób medyczny.

Ograniczenia badania WES
Mimo iż badania WES dają ogromne możliwości mają również swoje ograniczenia. Uzależnienie technologii od stosowanych paneli sond skutkuje tym, że nie jest możliwe wykrywanie zmian nie pokrytych zastosowanym panelem, jak np. inne zmiany głębokointronowe czy międzygenowe. Mimo, że takie panele są rozszerzane, aby pokrywać dodatkowo przynajmniej większość znanych wariantów patogennych zlokalizowanych w tych obszarach, to badanie WES nigdy nie umożliwi analizy wszystkich tego typu zmian – do tego służy badanie WGS, czyli sekwencjonowanie całego genomu. Technologia WES z wykorzystaniem sekwencjonowania następnej generacji (NGS) bazującego na krótkich odczytach, nie jest metodą dedykowaną wykrywaniu wariantów (mutacji) dynamicznych, jak np. zespół łamliwego chromosomu X (analiza regionu powtórzeń w obszarze genu FMR1). Ze względu na zmienność pokrycia różnych obszarów w WES, nie jest możliwe czułe wykrywanie mozaikowatości somatycznych o niskim poziomie lub występujących w innym typie tkanki niż badana. W ramach analiz CNV nie jest możliwe wykrywanie zmian strukturalnych obejmujących zrównoważone zmiany liczby kopii, a także translokacje oraz inwersje. Dodatkowo, obecność w genomie sekwencji homologicznych dla części genów, np. pseudogenów, znacznie obniża czułość detekcji zmian SNV i CNV w tych genach. Identyfikuje się też w eksomie tzw. martwe strefy genowe, w obrębie których nie ma możliwości identyfikacji wariantów genetycznych w technologii NGS. Ponadto, należy mieć na uwadze, ze żadna technologia nie jest idealna i podczas generowania danych sekwencyjnych wykrywane są także tzw. artefakty techniczne, które powinny zostać usuwane na etapie filtrowania – są to wyniki fałszywie pozytywne, tj., warianty, które realnie nie występują w DNA pacjenta. Możliwa jest też sytuacja odwrotna, kiedy prawdziwa zmiana genetyczna zostanie usunięta przez zbyt restrykcyjny filtr. Potrzeba dużego doświadczenia bioinformatycznego w analizie danych NGS, aby móc opracować odpowiednie filtry pozwalające na uzyskiwanie danych o wysokiej specyficzności i czułości. Te ograniczenia dotyczą wszystkich badań WES i wszystkich wykonujących je laboratoriów, dlatego też z tego względu lekarze mogą w niektórych przypadkach zalecać wykonanie innego typu badań, jak np. mikromacierze czy badanie kariotypu lub inne komplementarne badanie. Oczywiście, pomimo tych ograniczeń, badanie WES jest potężnym narzędziem diagnostycznym i światowe rekomendacje wskazują, że w wielu sytuacjach powinno być ono badaniem diagnostycznym pierwszego rzutu.